Laboratorio de Citometría de Flujo

La Citometría de Flujo (CMF) es una técnica de análisis celular multiparamétrico cuyo fundamento se basa en hacer pasar una suspensión de partículas (generalmente células) alineadas y de una en una por delante de un haz láser focalizado.

Unidad de análisis

Principios de la técnica

El impacto de cada célula con el rayo de luz produce señales que corresponden a diferentes parámetros de la célula y que son recogidos por distintos detectores. Estos convierten dichas señales en señales electrónicas que posteriormente serán digitalizadas para permitir la medida simultánea de varios parámetros en una misma célula.

En el momento de realizar las mediciones en el citómetro de flujo, las células pueden estar vivas o fijadas pero, siempre en suspensión celular y en forma de célula única. Al obligarlas a pasar alineadas una a una frente a un haz láser mediante un flujo continuo, cada célula, a la vez que dispersa la luz, si esa célula tiene alguna sonda fluorescente o fluorocromo, emitirá fluorescencia al ser excitada por el láser. Los parámetros que se miden de forma simultánea por cada célula son:

Dispersión frontal de la luz (forward scatter), valor proporcional al tamaño celular.
Dispersión de la luz ortogonal (side scatter), proporcional a la cantidad de estructuras granulares o complejidad de la célula.
Intensidades de fluorescencia a diferentes longitudes de onda.

Los citómetros de flujo están formados por complejos sistemas fluídicos, ópticos, detectores electrónicos, convertidores analógico-digitales y ordenadores.

El sistema fluídico permite un enfoque hidrodinámico del flujo celular hasta conseguir el alineamiento de las partículas o células con el láser.
Los sistemas ópticos permiten el enfoque del láser en un haz con un diámetro reducido para impactar sobre el menor número de partículas posibles simultáneamente y un sistema de espejos y filtros dirigen las señales producidas por ese impacto del láser sobre una célula para conducirlas hacia unos detectores o fotomultiplicadores.
El sistema electrónico se encarga de la cuantificación de los destellos de fluorescencia y de la luz dispersada transformándo esas señales de fluoresciencia en datos electrónicos. El ordenador permite almacenar datos de miles de células por cada muestra y representar los resultados gráficamente. Además de la representación gráfica, el software aporta varios datos estadísticos de las muestras analizadas entre ellos: media, mediana y coeficiente de variación.

Aplicaciones

Las aplicaciones fundamentales de esta técnica se dan en biología molecular y celular y medicina y son la identificación de antígenos celulares tanto de superficie como intracelulares mediante técnicas de inmunofluorescencia y el estudio del contenido de ADN y fases del ciclo celular.

La Citometría de flujo se utiliza en biomedicina en los siguientes campos:

En hematología: contaje celular, fórmula leucocitaria, contaje reticulocitario, análisis de médula ósea.
En farmacología: estudios de cinética celular.
En inmunología: Determinación de subpoblaciones linfocitarias, inmunofenotipificación de leucemias y linfomas.
En oncología: diagnóstico/pronóstico, monitorizar tratamiento.
En microbiología: diagnóstico bacteriano y vírico, sensibilidad a antibióticos.
En genética: cariotipo, diagnóstico de portador, diagnóstico prenatal.

En biología celular, la citometría de flujo permite estudiar numerosos parámetros celulares tales como la viabilidad, el metabolismo celular, algunas enzimas, la función mitocondrial y por supuesto expresión protéica y de receptores, consiguiendo así una caracterización celular amplia en casi cualquier tipo de cultivo celular. El gran número de células analizadas en citometría de flujo en relativamente poco tiempo, permite la obtención de gran cantidad de datos estadísticos que pueden ser usados en gran variedad de estudios y ensayos clínicos.

La Citometría de Flujo tiene varias aplicaciones dentro de otros campos, incluyendo, la biología vegetal y biología marina, en microbiología de los alimentos e incluso en agricultura (estudios de ploidia) y veterinaria (reproducción animal).

También es útil en el estudio de la ecología microbiana, muy importante en estudios medioambientales, a través del seguimiento y la identificación de microrganismos acuáticos y de ambientes extremos.

El tipo de muestras que se pueden analizar en citometría de flujo es muy variado y va desde cultivos celulares, células sanguíneas, células vegetales, e incluso en células extraídas de órganos. Los únicos requisitos serían conseguir una suspensión celular y que el tamaño de cada partícula esté en un rango aproximado de entre 0,5 y 40 µm de diámetro.

Además, existe un tipo especial de citómetros denominados citómetros sorter que además de analizar consiguen separar físicamente las células de interés (positivas para GFP o para cualquier otro parámetro) y recogerlas en tubos específicos o sobre placas en condiciones de esterilidad, permitiendo incluso su posterior cultivo.

Tipos de ensayo

A. Sorter MoFlo ASTRIOS:

Inmunofenotipajes celulares: 13 fluorescencias (MoFlo ASTRIOS).
Ciclo Celular en células fijadas o vivas, con Yoduro de Propidio, DAPI, Sytox.
Análisis Multiparamétricos funcionales y de expresión génica (GFP o antígenos de superficie).
Separaciones celulares de alta velocidad con la posibilidad de usar cualquiera de los modos de separación (Enriquecimiento, Pureza o Célula Única) y en condiciones de esterilidad. La separación es posible en diversos tipos celulares como células en suspensión, células adherentes, e incluso bacterias o algas.
Separación de células sobre cualquier tipo de soporte (portas, placas petri, placas 6, 12, 24, 48, 96 pocillos) incluyendo el clonaje de una única célula.
Detección de antígenos de superficie.

B. Citómetros analizadores: FACSCANTO II y Cytoflex S:

Detección de antígenos intracelulares.
Ciclo celular con Ioduro de propidio.
Estudios cinéticos de funcionalidad celular.
Estudios de prolifereación con CFSE.
Estudios de viabilidad celular: anexina V, TO-PRO.
Contaje de algas, bacterias, cianobacterias, etc.
Análisis Multiparamétricos funcionales y de expresión génica (GFP o antígenos de superficie).
Estrés oxidativo: DCFH, mitosox, DHE.
Ensayos de detección de citocinas solubles en sobrenadantes de cultivos.

Funcionamiento del servicio

Situación del laboratorio de citometria de flujo:

Facultad de Medicina. Campus de Medicina.

C/Arzobispo Morcillo nº 4 (frente al hospital de La Paz. Madrid).

Laboratorio B-6 (citometría de flujo). Planta Baja.

Para hacer uso del servicio o efectuar reservas en los equipos, es necesario estar dado de alta previamente como usuario del SIdI en la aplicación @lims.

Es IMPRESCINDIBLE contactar previamente con el Servicio de Citometría para planificar el experimento de Sorting a través del teléfono 914973128 o por la dirección de correo electrónico citometria.sidi@uam.es Para hacer una reserva de horas habrá que hacer una solicitud de ensayo previamente. La página para realizar la solicitud se encuentra disponible en la página web del SIdI a través del sistema LIMS.

Debe hacerse una reserva previa en la aplicación @LIMS para poder utilizar cualquiera de los citómetros.

El número asignado a esta solicitud de ensayo es necesario para poder realizar la reserva en un turno concreto. Si no se realiza la solicitud de ensayo NO se podrá reservar en el servicio de citometría

El laboratorio funciona bajo el sistema de gestión de calidad ISO9001.

El laboratorio forma parte de la Red de laboratorios e infraestructuras (RedLab) de la Comunidad de Madrid (CAM) (Laboratorio 314).
Puede consultar las TARIFAS en la página principal del SIdI: https://www.uam.es/uam/sidi. Los convenios establecidos con centros correspondientes a ambas tarifas se regirán por los precios pactados en cada caso concreto. Las tarifas no incluyen IVA en caso de facturación a organismos externos a la UAM