Laboratorio de Resonancia Magnética Nuclear

Mediante la Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) es posible estudiar el comportamiento de núcleos atómicos con spin nuclear distinto de cero en presencia de un campo magnético externo. La información que se obtiene está relacionada con la estructura molecular del compuesto.

Unidad de análisis

Principios de la técnica

La aplicación de un campo magnético externo sobre una muestra produce el desdoblamiento de los niveles degenerados de energía del spin nuclear, de modo que pueden inducirse transiciones entre ellos como consecuencia de la absorción de la radiación electromagnética adecuada. La disposición de los niveles de energía es una propiedad tanto de los núcleos de una molécula como de su entorno electrónico y de las interacciones entre ambos. Por ello, la intensidad, forma y posición de las señales obtenidas en el espectro de un núcleo determinado, están relacionadas con su estructura molecular. El análisis detallado del espectro de RMN proporciona información acerca de la estructura del compuesto que lo origina. Así, esta técnica resulta ser de las más eficientes y útiles para el estudio de la estructura y dinámica de moléculas en disolución.

Los núcleos analizables más habituales son ¹H y ¹³C. También se pueden medir todos los núcleos activos a la técnica, que resuenen en las frecuencias comprendidas en el rango de ³¹P-¹⁰⁹Ag, como por ejemplo: ³¹P, ¹⁹⁵Pt, ¹¹B, ¹¹⁹Sn, ⁷⁷Se, ¹¹³Cd, ¹⁹⁹Hg, ²⁰⁷Pb y otros.

Aplicaciones

Esta técnica se utiliza para el estudio de la estructura y dinámica de compuestos orgánicos, organometálicos y biomoléculas en disolución.

Algunas de sus principales aplicaciones son:

Caracterización estructural de compuestos de síntesis o aislados de medios de distinta naturaleza.
Confirmación de estructuras.
Identificación de compuestos.
Estudios de composición de mezclas de distintas procedencias: extractos biológicos, metabolitos, productos alimenticios, etc.
Determinación de pureza, cuantificación.
Movilidad molecular: determinación de conformaciones en disolución.
Seguimiento de procesos, reacciones, cinéticas.
Estudios de procesos de asociación.
Estudios a alta y baja temperatura.
Determinación de exceso enantiomérico.

Tipos de ensayo

Espectros monodimensionales:

¹H : adquisición normal, experimentos de doble resonancia y de NOE 1D-selectivo
¹³C: adquisición de espectros acoplados/desacoplados de ¹H, experimentos DEPT
Otros heteronucleos: ¹¹B, ²⁷Al, ¹⁹F, ²⁹Si, ³¹P, ¹¹³Cd, ¹¹⁹Sn, ¹⁹⁵Pt, etc.

Experimentos bidimensionales:

Correlación homonuclear: COSY, TOCSY, NOESY, ROESY.
Correlación heteronuclear: HMQC, HSQC, HMBC.
Experimentos de difusión (DOSY)

Funcionamiento del servicio

Condiciones generales y específicas de las muestras

Las muestras a analizar pueden llegar al laboratorio preparadas previamente en el tubo de RMN por el propio usuario. La preparación por parte del laboratorio de RMN de la muestra conlleva un coste adicional (ver tarifas). La cantidad de muestra necesaria para realizar espectros de 1H es de unos 5-10 mg. En otros casos dependerá del tipo de experimento a realizar (consultar con el laboratorio en caso de duda).

Las muestras deben llegar a la recepción del SIdI junto con la solicitud de ensayo y perfectamente identificadas mediante una etiqueta (nunca pegada sobre el tubo) con una referencia que coincida con la que se indica en la solicitud de ensayo. Para la identificación pueden utilizarse estas etiquetas (ver área de descargas más abajo).

En caso de que la muestra tenga que er preparada por el Servicio de RMN, esta se debe identificar perfectamente en el medio en el que e entregue (vial, tubo, eppendorf, etc.) y el usuario debe asegurarse de que es soluble en el disolvente deuterado indicado en la solicitud. La preparación de estas muestras se limitará exclusivamente a la disolución de los productos en el disolvente deuterado indicado por el usuario, sin tratamientos ni condiciones especiales. Para otros casos, deberán ponerse en contacto previamente con el laboratorio. Los disolventes deuterados disponibles en el Servicio (importe según tarifas vigentes) son: Acetona-d6, Benceno-d6, DMSO-d6, Cloroformo-d, D2O, Tetracloroetano-d2, Diclorometano-d2, Metanol-d4.

Cuando se entreguen muestras cuya manipulación exija guardar precauciones especiales debido a su inestabilidad, alta toxicidad, inflamabilidad, alta volatilidad, riesgo biológico, etc, estas características deberán indicarse expresamente en la solicitud de ensayo.

Preparación de muestras de RMN

Disolvente

Se debe elegir un disolvente en el que la muestra sea suficientemente soluble, cuyas señales interfieran lo menos posible con las de las sustancias a analizar y que se ajuste a las condiciones de temperatura a las que se va a llevar a cabo el experimento. El volúmen necesario es de 0.6-0.7 ml para tubos de 5mm de diámetro. Existen varios artículos en lo que se muestran las impurezas más comunes asociadas a los diferentes disolventes.

J.Org.Chem. 1997, 62,21,7512-7515

Organometallics 2010 29,9,2176-2179

Tubo

Utilizar tubos para experimentos de alta resolución y adecuados al campo/equipo en que se va a trabajar y a las condiciones de temperatura a las que se pueda someter.

Utilizar tubos que estén en óptimas condiciones de uso. Cuando el estado del tubo implique algún tipo de riesgo en su manipulación debido a la presencia de bordes cortantes, o tapones que no ajustan debidamente o cuando la longitud del tubo o el volumen de disolvente sean insuficientes (altura mínima de 15cm), serán devueltos a los usuarios para que preparen la muestra de manera más apropiada.

Limpiar los tubos nuevos antes de usarlos por primera vez ya que pueden tener restos de grasa o impurezas.

Al limpiar los tubos hay que tener la precaución de no rayarlos y de no utilizar reactivos que puedan atacar al vidrio o que lleven impurezas paramagnéticas difíciles de eliminar (p.e. mezcla crómica).

Los tubos no se deben exponer a altas temperaturas (p.e. durante el secado) ya que pueden perden sus propiedades de homogeneidad y/o concentricidad.

Muestra

Cantidad mínima de muestra: 1H 1-10 mg; 13C>20 mg. Para otros núcleos/experimentos consultar al laboratorio. Las disoluciones deben ser claras, sin residuos sólidos, con una concentración homogénea. Si es necesario, conviene filtrar la disolución antes de introducirla en el tubo. una mala disolución puede afectar a la resolución del experimento.

Forma de solicitar los análisis

Las muestras deben ir acompañadas de la solicitud de ensayo generada en LIMS. El usuario debe rellenar todos los campos de la solicitud de ensayo que conozca, con objeto de obtener el mejor resultado posible.

En una misma Solicitud pueden incluirse una o varias muestras y, en cada una de ellas, uno o varios experimentos siempre que se vayan a realizar en el mismo equipo (AV III-HD 300 ó DRX-500). Los resultados se entregarán una vez finalizados todos los experimentos solicitados.

Si el estudio a realizar presenta dificultades técnicas o analíticas fuera de lo común o el producto es poco estable, se recomienda ponerse en contacto con el laboratorio antes de enviar o preparar dichas muestras.

Entrega de los resultados

El plazo de entrega de los resultados dependerá de la duración y características del experimento solicitado. En la aplicación LIMS se adjuntan los datos de RMN de las solicitudes de manera que cada usuario puede acceder a los resultados de sus muestras en cualquier momento. Para ello, hay que entrar nuevamente en la solicitud, una vez que haya sido completada tota l(solicitud CERRADA) o parcialmente (solicitud EN CURSO). A la derecha del todo, en las casillas sombreadas en gris, en la casilla con encabezado "Resultados Parciales. A rellenar por SIdI", aparecerá el fichero correspondiente a los datos de la muestra (en formato zip, por ser un directorio). Al pinchar sobre este fichero, se podrá descargar en vuestro ordenador, descomprimir y abrir con un software específico para datos de RMN (TOPSPIN, MNova, MestreC, ACD Labs).