Facultad de Ciencias

María Inés Morán Valero

Directores: Dr. Carlos Torres, Dra. Diana Martín

Antecedentes y estado actual del tema

En la actualidad existe un gran interés por los alimentos funcionales; aquellos que han sido diseñados, no sólo para satisfacer necesidades nutricionales, sino para llevar a cabo una función específica adicional, como puede ser, mejorar el estado fisiológico y de salud, o reducir el riesgo de contraer enfermedades. Así, en las últimas décadas este tipo de alimentos ha emergido de forma clara dentro de la industria alimentaria, despertando un gran interés aquellos alimentos funcionales que producen efectos beneficiosos como potenciar el sistema inmune, prevenir diversos tipos de cánceres, prevenir enfermedades cardiovasculares o disminuir el colesterol en sangre (1, 2).
Por otro lado, existe una percepción negativa sobre los lípidos o grasas, debido a que son frecuentemente relacionadas con las patologías anteriormente mencionadas. Aunque es cierto que muchas grasas van acompañadas de esta connotación negativa, no todas ellas son perjudiciales. Los lípidos son esenciales para nuestro organismo; son la mayor fuente de energía, son constituyentes de las membranas celulares y son precursores de hormonas o análogos que actúan como efectores fisiológicos (3). Además, varios de ellos son considerados lípidos funcionales o bioactivos, siendo utilizados en la prevención y tratamiento de algunas patologías crónicas de base inflamatoria, enfermedades cardiovasculares o cáncer. Destacan los ácidos grasos de cadena corta y media, los ácidos grasos omega-3, como eicosapentanoico (EPA) o docosahexanoico (DHA), el ácido linoleico conjugado (CLA), el ácido oléico, el ácido ¿-linolénico o el ácido ¿-linolénico (4, 5, 6). 
En base a estos antecedentes, la producción de lípidos estructurados con ácidos grasos que tienen propiedades funcionales o terapéuticas constituye hoy en día una línea de gran interés. Los lípidos estructurados son moléculas lipídicas modificadas de su estado natural biosintético mediante métodos químicos y/o enzimáticos para la obtención de estructuras lipídicas con un mejorado perfil nutricional, biodisponibilidad y/o actividad biológica. De este modo se pueden aunar en una única molécula las ventajas propias de distintos ácidos grasos específicos (1, 2).
La molécula que se utiliza comúnmente como vehículo de integración de varios ácidos grasos de interés es la glicerina en forma de triacilglicerol, en la cual los tres grupos hidroxilo del glicerol se encuentran  esterificados por ácidos grasos (7). El ejemplo más representativo de estos triacilgliceroles estructurados es aquel que contiene ácidos grasos de cadena corta o media en las posiciones sn-1 y sn-3, y un ácido graso de cadena larga o un ácido graso bioactivo en la posición sn-2, existiendo formas comerciales de estas estructuras como son Salatrim, Caprenin, Captex o Structolipid (8). Actualmente, gracias a tecnologías como la enzimática, el concepto de lipido estructurado se está ampliando a otras familias lipídicas que permiten la combinación de compuestos bioactivos en una misma molécula, como pueden ser los fosfolípidos, los esteroles y los alquilgliceroles (8). Los fosfolípidos están formados por un grupo fosfato en la posición sn-3 de la glicerina, en la cual se pueden encontrar esterificados ácidos grasos en posición sn-1 y sn-2. Los esteroles pertenecen a la familia de los triterpenos y consisten en una estructura tetracíclica procedente del núcleo de ciclopentanoperhidrofenantreno con una cadena lateral en el C-17, pudiendo llevar esterificados ácidos grasos en la posición C-3 del primer anillo. Por otro lado, cuando al menos un grupo hidroxilo del glicerol presenta el enlace de una cadena larga alquílica o alquenílica mediante una unión de tipo éter, en lugar del enlace éster habitual, la estructura es conocida como alquilglicerol o éter lipídico, pudiendo encontrarse las posiciones sn-2 y sn-3 esterificadas con distintos ácidos grasos (9).
Hay que destacar que, además de poder ser utilizados como vehículos de ácidos grasos de interés, los fosofolípidos, los esteroles y los alquilgliceroles presentan el atractivo adicional de poseer también propiedades bioactivas por sí mismos. Los fosfolípidos son principalmente utilizados como segundos mensajeros frente a varias respuestas biológicas, como son la respuesta inmune, la agregación plaquetaria y la proliferación y diferenciación celular (10). Los fitoesteroles o esteroles de origen vegetal, son reconocidos como agentes hipocolesterolémicos que interfieren en la absorción intestinal de colesterol, además, de presentar actividad anti-cancerígena, anti-inflamatoria,  anti-oxidativa y actividad frente a la ateroesclerosis (11). Por otro lado, los éteres lipídicos o alquilgliceroles son especialmente usados en la terapia del cáncer, dado que son potentes agentes antineoplásicos que inhiben el crecimiento e inducen la diferenciación y apoptosis de las células cancerígenas, así como son agentes estimulantes del sistema inmune (12). Por tanto, en base a estos antecedentes, la producción de fosfolípidos, esteroles o alquilgliceroles estructurados con ácidos grasos bioactivos, como ácidos de cadena corta, de cadena larga o poliinsaturados, como el grupo de los omega-3 o el CLA, resulta de interés, al permitir la integración de las propiedades bioactivas de ambos compuestos en la misma molécula.
No obstante, a la hora de plantear la forma de integración más idónea de ácidos grasos funcionales en forma de lípidos estructurados, surgen una serie de interrogantes acerca de si la utilización de una u otra estructura resultará más ventajosa o, por el contrario, supondrá un inconveniente con respecto al resto de estructuras lipídicas , en cuanto a aspectos como la estabilidad y eficiencia de transporte en plasma, difusión a través de membranas biológicas o metabolización intracelular y, especialmente, en cuanto a su bioaccesibilidad en el proceso de digestión en el tracto gastrointestinal como paso previo a cualquier otra acción fisiológica.
La digestión de los triacilgliceroles en el tracto gastrointestinal se desarrolla fundamentalmente por acción de la enzima lipasa pancreática. Esta enzima actúa preferentemente sobre los ácidos grasos esterificados en las posiciones sn-1 y sn-3 del glicerol, liberando 2-monoacilgliceroles y ácidos grasos libres. Estos productos de digestión se incluyen en micelas mixtas, lo cual facilita su acceso al enterocito y absorción por parte del mismo (13). Respecto a la digestión de los fosfolípidos, es principalmente llevada a cabo en el lumen del intestino delgado por acción de la enzima fosfolipasa A2. Esta enzima hidroliza los ácidos grasos de la posición sn-2 liberando ácidos grasos libres y liso-fosfolípidos, manteniendo un ácido graso en la posición sn-1 (14). Por otro lado, la principal enzima responsable de la hidrólisis de los esteroles en el tracto gastrointestinal es la esterol esterasa, liberando los ácidos grasos que se encuentran unidos a la estructura principal (15). En el caso de los alquilgliceroles esterificados, la información existente en cuanto a su digestión en el lumen intestinal es escasa, y las evidencias sugieren que la actividad de la lipasa pancreática sobre los ácidos grasos esterificados de los alquilgliceroles es limitada. 
Los modelos de digestión intestinal in vitro permiten llevar a cabo estudios preliminares de la bioaccesibilidad de lípidos de interés así como de las especies lipídicas que se liberan, simulando las condiciones pseudo-fisiológicas que ocurren en el intestino. Estos modelos se basan fundamentalmente en la combinación en el medio de reacción de enzimas digestivas, para llevar a cabo la hidrólisis de los compuestos lipídicos; de lecitina y sales biliares, para facilitar la formación de las micelas; y de un tampón de pH fisiológico, para simular las condiciones óptimas de pH del intestino (16). El estudio posterior de las composición de las estructuras micelares que se forman en el medio de reacción, suele acompañar a los modelos de digestión in vitro para completar la información relativa a la bioaccesibilidad de los lípidos. Sin embargo, a pesar de estos elementos comunes de la mayor parte de los modelos, existe una gran variabilidad en la literatura científica en cuanto a una serie de parámetros, como son la relación enzima-sustrato, la concentración lecitina-sales biliares, el pH utilizados en los modelos, o el procedimiento de separación posterior de estructuras micelares (17). Por otro lado, la mayor parte de los modelos in vitro que se pueden encontrar en la bibliografía han sido desarrollados fundamentalmente para la simulación de la digestión de lípidos habituales en forma de triglicéridos, siendo aplicados indistintamente para otras formas lipídicas, incluidos lípidos estructurados o de síntesis, sin tener en cuenta las particularidades propias de la digestión de los distintos lípidos, tal y como se ha expuesto anteriormente. Por tanto, dada la utilidad de los modelos de simulación in vitro a la hora de obtener una valiosa información preliminar sobre la potencialidad de nuevas estructuras lipídicas, resulta fundamental una cuidada optimización de las condiciones de los modelos de digestión in vitro para cada caso particular, de tal forma que la simulación del proceso digestivo sea lo más próxima posible a una situación fisiológica.
En base a los antecedentes expuestos, el presente proyecto pretende realizar un estudio comparativo del proceso de digestión in vitro de lípidos estructurados con ácidos grasos potencialmente bioactivos, como ácidos grasos de  cadena corta y ácidos grasos poliinsaturados tipo omega-3 o CLA, tanto en forma de triacilgliceroles, fosfolípidos, esteroles o alquilgliceroles. De este modo se pretende obtener información mecanística de cómo estos vehículos lipídicos son reconocidos e hidrolizados por las lipasas digestivas y cuáles son los productos de la digestión obtenidos que potencialmente serían absorbidos  y pasarían al plasma para ejercer allí su acción biológica. Previamente, será necesaria la optimización de diferentes modelos de digestión intestinal in vitro de distintas estructuras lipídicas naturales análogas a los ¿lípidos problema¿, que  permitan obtener resultados similares a lo que sucede en la digestión intestinal in vivo y sean aplicables a los diferentes lípidos de síntesis, de diseño o desconocidos, con el fin de entender con precisión los resultados obtenidos y poder evitar interpretaciones incorrectas de los resultados debidas a la propia metodología utilizada.

Objetivos de la investigación

Los objetivos del presente proyecto son:
1.    Optimización de modelos de digestión intestinal  in vitro específicos de lípidos naturales en forma de fosfolípidos, esteroles o alquilgliceroles.
2.    Aplicación de los modelos de digestión in vitro desarrollados para el estudio de lípidos estructurados en forma de fosfolípidos, esteroles o alquilgliceroles con ácidos grasos bioactivos.

Metodología, hipótesis y plan de trabajo

Para llevar a cabo los objetivos planteados en el presente proyecto, se desarrollará el siguiente plan de trabajo:
Tarea 1: Optimización de modelos de digestión intestinal  in vitro
Para desarrollar esta primera etapa, se realizará la puesta a punto de diferentes métodos de digestión in vitro de los lípidos en condiciones fisiológicas, que aseguren una digestión lipídica lo más completa posible.
Basándose en la bibliografía científica existente y en estudios preliminares llevados a cado por el grupo, se optimizarán las condiciones de los modelos atendiendo a una serie de variables específicas del proceso de digestión fisiológico de cada grupo lipídico de estudio.
 Por tanto, será necesario considerar las siguientes variables:

- Tipo de enzima. Teniendo en cuenta que el proceso de hidrólisis de cada tipo lipídico es llevado a cabo por distintas enzimas (fosfolipasa A2, esterol esterasa y lipasa pancreática)o incluso por varias de ellas, será necesario evaluar en cada caso, cuál o cuáles se utilizarán, estableciéndose o no combinaciones de las mismas en cada caso particular. Por otro lado, se evaluará el uso de enzimas purificadas o el uso de un extracto obtenido a partir de la secreción pancreática, que aseguren la digestión lo más completa posible.
- Tipo de sustrato lipídico. En cada caso concreto se utilizará como sustrato un "lípido estándar", siendo este un lípido común y abundante en la dieta, con estructura y características químicas conocidas y similares a las del lípido estructural análogo que se pretenda evaluar. 
- Relación concentración de enzima/concentración de sustrato. La optimización del tipo de enzima implicará la evaluación simultánea de la relación enzima/sustrato en cada tipo de modelo.
- Otros componentes del medio de reacción. Será necesario valorar y ajustar el resto de componentes que forman el medio de reacción, como son sales biliares, cloruro sódico, cloruro cálcico, lecitina, así como la fuerza, pH o composición del tampón de reacción. Para el caso concreto de la digestión in vitro de los fosfolípidos será necesario evaluar el efecto de la lecitina, ya que podría ser digerida junto al producto de interés interfiriendo en los resultados finales.
- Tiempo de reacción. Se evaluará el tiempo de digestión de cada uno de los lípidos, con la finalidad de conocer el tiempo en el cual se  consigue una hidrólisis lo más completa y fisiológica posible. 
- Utilización de finalizadores de la reacción: por desnaturalización enzimática por cambio de temperatura o de pH.
- Utilización de un "lípido de acompañamiento". Se considerará la inclusión de" lípidos de acompañamiento", definiéndose como el lípido que se añade al medio de digestión con el fin de ayudar en la hidrólisis de un lípido específico, simulando aún más una situación real, en la que se digieren lípidos de distinta naturaleza y composición de la dieta, en lugar de lípidos aislados.

El conjunto de esta actividad constituirá uno de los bloques más extensos de tareas, ya que el proceso de optimización de los modelos de digestión in vitro, así como de las herramientas analíticas, implicarán la evaluación de diversas condiciones y variables. 
Tanto la optimización de los modelos de digestión in vitro, como la aplicación de los mismos, serán llevadas a cabo en un medio de reacción que simula la composición del contenido intestinal en condiciones fisiológicas (sales biliares, fosfolípidos, triacilgliceroles, colesterol, tampón a pH fisiológico y enzimas pancreáticas). Dicho medio se incluye en un recipiente de doble camisa termostatizado acondicionado para mantener el pH y la temperatura óptimos de la reacción (valorador automático Titrino Plus), así como una agitación continuada del medio de digestión.

El proceso de optimización de los modelos de digestión intestinal in vitro se realizará mediante la aplicación de los siguientes pasos:
- Evolución del proceso de digestión en el tiempo. Mediante la toma de alícuotas a lo largo del tiempo de digestión, se analizará la variación en productos de hidrólisis y se estimará el grado y velocidad de hidrólisis, así como el tiempo final de reacción. Este tipo de ensayo, y sus réplicas correspondientes, se aplicará para evaluar la selección de las variables específicas más idóneas.
- Evaluación de la composición de las fases del medio de digestión. Optimizadas las condiciones anteriores, se realizará de nuevo el proceso de digestión hasta tiempo final, y el medio completo de reacción se someterá a centrifugación, separándose así la fase oleosa de la fase micelar. Se analizará la composición lipídica de las fases separadas, esperando encontrar, en la fase oleosa aquellos compuestos lipídicos que no han sido completamente hidrolizados y en la fase micelar aquellas especies lipídicas liberadas de la hidrólisis de los lípidos. El estudio de la composición de la fase micelar permitirá obtener información de la bioaccesibilidad de cada caso particular. 
Por otro lado, se realizará un contaje de las estructuras micelares mediante cámara de Neubauer y microscopio óptico. Este dato permitirá conocer el número de micelas que se forman en el medio de reacción y su evolución a lo largo del tiempo de digestión, así como establecer relaciones entre el número de micelas y las distintas especies lipídicas liberadas durante la hidrólisis. 
- La caracterización de los productos de digestión de todas y cada una de las pruebas de optimización y de las tareas posteriores se realizará mediante cromatografía HPLC-ELSD, GC-FID y GC-MS. Para ello, será previamente necesario separar los productos lipídicos de digestión del medio acuoso de reacción mediante extracción con disolventes orgánicos, siendo necesario evaluar y seleccionar la mezcla de disolventes más adecuada que asegure una completa extracción de los productos lipídicos de digestión para su cuantificación. Posteriormente, se optimizarán las condiciones cromatográficas que aseguren la mejor identificación y cuantificación posible de los compuestos lipídicos mediante las curvas de calibrado con patrones correspondientes y el cálculo de factores de respuesta.

Tarea 2: Aplicación de los modelos de digestión in vitro desarrollados para el estudio de lípidos estructurados con ácidos grasos bioactivos.
El segundo paso para desarrollar el presente trabajo se basa en la aplicación de los modelos previamente optimizados a los distintos lípidos estructurados.  Hay que señalar que estos lípidos serán sintetizados por otros miembros del grupo de investigación, por lo que se trabajará en estrecha colaboración y coordinación con los mismos.

A)    Estudios generales
La evolución del proceso de digestión, la evaluación de la composición de las fases del medio de digestión, la extracción lipídica de la fase micelar, así como la caracterización de los productos lipídicos extraídos para cada ¿lípido problema" se llevará a cabo del mismo modo previamente optimizado en la tarea 1 para lípidos estándar.

B)    Estudios específicos
- Además de los pasos anteriormente mencionados, se realizarán una serie de ensayos particulares para cada compuesto lipídico, que consistirán en su inclusión en el medio de reacción a los distintos niveles de ingesta que han sido recomendados para ejercer un efecto bioactivo concreto, según el tipo de lípido estructurado.  Se atenderá a niveles de ingesta recomendada, tanto del ácido graso bioactivo esterificado en el lípido estructurado, como de la propia forma lipídica estructurada (esteroles, alquilgliceroles, fosfolípidos). Esta tarea requerirá una cuidada revisión bibliográfica acerca de las cantidades mencionadas, ya que los rangos de ingesta recomendada son amplios y variables entre los diversos lípidos estructurados de estudio, por lo que se evaluarán varios niveles de inclusión en cada caso, de acuerdo con la literatura científica. 
- Por otro lado, se realizarán digestiones específicas en determinados grupos de lípidos estructurados según una serie de particularidades de los mismos. Así, en el caso concreto de aquellos lípidos en forma de esteroles, y teniendo en cuenta que su reconocido efecto hipocolesterolémico ha sido relacionado a nivel de la digestión intestinal, se evaluará mediante el modelo de digestión optimizado, la combinación de esteres de esteroles bioactivos y colesterol en el medio de reacción, a niveles de la ingesta recomendada de fitoesteroles que supone un efecto hipocolesterolémico, en combinación con niveles medios de ingesta de colesterol. 
- Finalmente, se platearán estudios comparativos entre las distintas estructuras lipídicas estudiadas en cuanto a la información mecanística obtenida de cómo estos vehículos lipídicos son reconocidos e hidrolizados por las lipasas digestivas y cuáles son los productos de la digestión obtenidos que potencialmente serían absorbidos  y pasarían al plasma para ejercer allí su acción biológica, tratando de identificar aquellas estructuras lipídicas de síntesis que pudieran presentar ciertas ventajas en cuanto a bioaccesibilidad respecto a sus análogos naturales o respecto a otras formas estructuradas.