Facultad de Ciencias

Daniel Tenllado van der Reijden

Directores: Dr. Guillermo Reglero, Dr. Carlos Torres

La síntesis de un lípido estructurado o la vehiculización lipídica de una sustancia con interés biológico necesita apoyarse sobre diversas tecnologías para ser llevada a cabo. Estas tecnologías deben ser escalables industrialmente, baratas y limpias, tanto para el medio ambiente como para obtener un producto final sin impurezas. 
Durante el proceso de síntesis es necesario conocer en todo momento la composición de las muestras con las que se trabaja, para lo cual el grupo en el que ha trabajado el doctorando trabajo cuenta con métodos de análisis publicados [1] y con los que se trabaja de forma habitual. 
Con el objetivo de tener una nueva herramienta de análisis y hacer más robusta la cuantificación de las muestras, se realizó el desarrollo de un nuevo método de cromatografía de gases. Se trataba de dividir la muestra en el cromatógrafo por clases de lípidos y poder cuantificarlos sin necesidad de realizar una preparación previa de la muestra, para lo cual se realizó una inyección directa en la columna. Para la cuantificación de las muestras inyectadas se utilizaron dodecano y hexadecano como patrones internos. Se obtuvo un factor de respuesta para cada uno de los analitos bajo estudio por medio de cinco inyecciones sucesivas de patrones puros a concentraciones conocidas [2]. En todos los casos la resolución de los diferentes picos fue superior a 3.5, lo que indica una separación completa de todos los componentes bajo estudio. Se estudió la variación en la respuesta al analizar las sustancias tanto entre días diferentes ¿inter-day¿, como dentro de un mismo día ¿intra-day¿. Para determinar la variación inter-day se realizaron seis inyecciones de la mezcla lipídica sometida a estudio durante cinco días diferentes a lo largo de todo un mes. Se obtuvo un alta reproducibilidad en los tiempos de retención y una aceptable precisión en la respuesta. Hay que considerar que la variación inter-day de la respuesta fue menor de 6 excepto para los tocoferoles. Este resultado, junto con la aparición de color en la mezcla sometida a evaluación, indicó que los tocoferoles sufrieron oxidación durante 
el almacenamiento de la mezcla lipídica bajo estudio. El resto de compuestos fueron estables durante todo el estudio y produjeron una escasa variación en sus respuestas y tiempos de retención. La desviación estándar relativa de la variación intra-day para los tiempos de retención y las áreas nunca fue superior a 1 y 10 respectivamente. Para validar el método cromatográfico desarrollado, se inyectaron diferentes muestras lipídicas obtenidas en el laboratorio, y se cuantificaron utilizando los factores de respuesta obtenidos. Se cuantificó un destilado desodorización de aceite de soja, una mezcla de ésteres de esterol producida durante una esterificación enzimática de esteroles con ácidos grasos procedentes de la leche, y un producto intermedio de la alcoholisis química de aceite de hígado de tiburón. Con el método publicado por Torres-Vázquez [1] es posible conocer la composición de una muestra en clases o familias de lípidos. El método descrito de cromatografía de gases ¿on column¿, en combinación con este, proporciona una herramienta robusta y eficaz para el análisis de muestras lipídicas. El método descrito por Torres-Vázquez, por ejemplo, indica qué concentración de ácidos grasos libres, esteroles y ésteres de esteroles hay en una mezcla concreta. En cambio el método publicado por Torres-Tenllado [3] divide estas familias lipídicas por longitudes de cadena, es decir, indica cuántos ácidos grasos libres hay en la muestra, cuantos esteroles y cuantos esteres de esteroles. Incluso es posible identificar el ácido graso, el esterol y el éster de esterol. Para ilustrar este ejemplo se analizó el producto de una esterificación enzimática de fitoesteroles con grasa láctea en la que se separaron 24 ésteres de esterol diferentes procedentes de la esterificación. En la muestra existen tres tipos principales de esteroles (campesterol, estigmasterol y sitosterol) y ocho ácidos grasos diferentes, con lo que se pueden formar 24 tipos diferentes de ésteres de esterol. Mediante la combinación entre el número de esteroles y de ácidos grasos, es posible conocer el número de especies de ésteres de esteroles presentes. Este resultado muestra la versatilidad de este método y lo adecuado del mismo para trabajar junto a otros métodos de análisis como el HPLC y GC split-splitless. 
La biocatálisis enzimática ha demostrado ser una herramienta eficaz, selectiva y limpia, tanto para la síntesis como para la catálisis de un lípido. El uso de enzimas en alguna etapa industrial implica un alto coste del proceso, por lo que la reutilización del biocatalizador se hace imprescindible. A su vez la reutilización de la enzima debe hacerse de tal manera que el producto obtenido sea siempre el mismo, no importando el ciclo de reutilización de un mismo lote de biocatalizador. Para esto es necesario modelar la cinética de la reacción enzimática considerando la desactivación de la enzima como uno de los parámetros clave. 
Tras diversos ensayos utilizando diferentes enzimas en multitud de condiciones de reacción, se decidió trabajar con la lipasa de Pseudomona cepacia (recientemente reclasificada como Burkhoderia cepacia) en reacciones de alcoholisis, ya que producía una elevada conversión de triglicéridos (90%) en tiempos reducidos y su reutilización era factible, puesto que su desactivación en reacciones de alcoholisis era muy reducida. Para trabajar con esta lipasa se puso a punto un método de inmovilización que permitió recuperar la enzima después de cada ciclo de reacción. 
Se pudo apreciar cómo las concentraciones de FAEE presentes en la mezcla de reacción variaron durante los ciclos 2º, 5º, 10º, y 15º. La concentración de los FAEE a las 6 horas de reacción en los ciclos 2º, 5º,10º y 15º fueron de 1104.3, 897.7, 613.9 y 441.8mM respectivamente. Estos resultados indicaron que la desactivación de la lipasa tenía un efecto significativo en la producción de FAEE. Si la desactivación fuese despreciable se habrían obtenido niveles de FAEE similares en los cuatro ciclos bajo estudio. Para describir la perdida de actividad de la enzima con el tiempo se incorporó un término de desactivación en el modelo cinético. Con el fin de mejorar la calidad del ajuste se utilizó una expresión matemática para describir la desactivación enzimática que consideraba un mecanismo de desactivación irreversible acompañado de forma paralela por un reordenamiento irreversible de la lipasa produciendo una forma estable activa. Los valores obtenidos con este modelo de desactivación enzimática proporcionaron un buen ajuste de los valores obtenidos con los datos experimentales. 
Este resultado indicó que el mecanismo más probable para la desactivación de la lipasa seguía dos procesos paralelos que conducían a una forma estable y activa de la lipasa, y a otra forma inactiva. Debido a esto este modelo de desactivación fue empleado en la predicción de tiempos de reacción para la reutilización óptima del biocatalizador. La incorporación de este término de desactivación enzimática permitia usar el concepto de pseudo-tiempo de reacción, que transforma los tiempos de reacción de cada ciclo en sus correspondientes nuevos valores, es decir, los que se habrían obtenido si la enzima no hubiera sido parcialmente desactivada. 
El concepto de pseudo-tiempo de reacción responde a la desactivación de la lipasa y permite el ajuste de los datos cinéticos de las diferentes reacciones llevadas a cabo con el mismo lote de lipasa pero con diferentes grados de desactivación. Una aplicación importante de este concepto fue poder predecir cuánto tiempo más debía permanecer la mezcla de reacción en contacto con la lipasa, para conseguir un determinado grado de alcoholisis, dependiendo del grado de desactivación de la lipasa utilizada. 
Se realizó una primera predicción con el mismo lote de la lipasa empleada en los 15 ensayos anteriores. Este lote correspondía a una lipasa inmovilizada que estuvo trabajando en reacciones de alcoholisis durante 90 horas. El objetivo seguía siendo obtener una conversión del 90% de TAGs, lo que producía una concentración de FAEE de 933.7mM, que se fijó como objetivo. Esta concentración debía alcanzarse sin tener en cuenta la actividad residual de la lipasa utilizada. De acuerdo con el modelo de desactivación propuesto, el pseudo-tiempo de reacción que producía esta concentración de FAEE fue de t*=2.772 h. Finalmente utilizando la ecuación obtenida con el 
modelo cinético fue posible predecir el tiempo necesario que debía durar el 16º ciclo para obtener la concentración molar de FAEE fijada como objetivo. Este tiempo de reacción resultó ser de 19.7h. Se llevó a cabo experimentalmente el 16º ciclo de alcoholisis durante 19.7h obteniendo una concentración de FAEE de 876.0mM. Este resultado reveló una razonable concordancia entre la conversión experimental y la predicha por el modelo cinético. 
Como ejemplo de vehiculización lipídica de una sustancia de interés biológico e industrial se llevó a cabo el estudio de la esterificación de tirosol con ácido graso oleico. Este estudio se centró en conocer el efecto de las distintas variables que intervenían en el proceso. La reacción se llevo a cabo en condiciones equimolares y en un medio de reacción sin disolventes. Se estudiaron los efectos del tamaño de partícula del tirosol, de la temperatura, concentración del biocatalizador y presión reducida. Además se llevaron a cabo estudios de reutilización del biocatalizador así como de actividad antioxidante mediante la prueba del rancimat. Todos estos estudios se realizaron comparando la lipasa de Candida antárctica inmovilizada en aglomerados de octil-sílice con la lipasa de Candida antarctica inmovilizada por Novozym (435). 
Cabe señalar que el tirosol no es soluble en ácido oleico en las condiciones de reacción ensayadas, y que una posible limitación en la velocidad de reacción es la velocidad de disolución del tirosol en el medio de reacción. Ha sido descrito con anterioridad que cuanto menor sea el tamaño de partícula de los reactivos, más rápida será la velocidad de reacción [4]. Las limitaciones de transferencia de materia asociadas a la velocidad de disolución del tirosol en la mezcla de reacción, fueron estudiadas usando tirosol comercial y tirosol tamizado con un tamaño de partícula inferior a 0,1 mm. Se logró mayor velocidad de reacción mediante el uso de tirosol con tamaño de partícula inferior a 0,1 mm. Cabe señalar que en los tiempos de reacción cortos (60 y 90 minutos), usando tirosol tamizado, la velocidad de reacción fue aproximadamente 3 y 2 veces más rápida que con el tirosol original. Sin embargo se obtuvo una conversión final similar en los dos casos bajo estudio. En los experimentos posteriores se utilizó el tirosol tamizado como sustrato de la reacción. 
Se evaluó la solubilidad del tirosol en la mezcla de reacción para lo que se llevaron a cabo dos pruebas diferentes. En primer lugar se comparó la solubilidad del tirosol en ácido oleico a 40,50 y 60ºC. También se determinó la solubilidad del tirosol en oleato de tirosol a 50ºC. Los resultados obtenidos indicaron una muy baja solubilidad del tirosol en ácido oleico, sin embargo la solubilidad del tirosol en oleato de tirosol fue 4 veces superior. Estos resultados indicaron que el oleato de tirosol producido en la reacción de esterificación mejoraba la solubilidad del tirosol en la mezcla de reacción, por lo que este podía contribuir positivamente en la velocidad de reacción de esterificación. 
La esterificación enzimática de tirosol con ácido oleico fue estudiada a tres temperaturas diferentes (40, 50 y 60ºC) con ambas enzimas. Como era de esperar, cuanto mayor fue la temperatura mayor fue la velocidad de esterificación observada. Se alcanzó el equilibrio de reacción cuando el oleato de tirosol llegó a concentraciones del 73% w/w a 40ºC, del 76% w/w a 50ºC y del 79% w/w a 60ºC. En todos los casos bajo estudio la velocidad de esterificación fue más rápida en presencia de Novozym 435 que en presencia de los aglomerados de octil-sílice de la lipasa Candida antarctica. La menor actividad de la lipasa inmovilizada en los aglomerados, en comparación con la comercial, probablemente fue debida a una menor carga de lipasa de Candida antarctica en los aglomerados. Con el fin de preservar en lo posible la actividad de la lipasa y minimizar la volatilización y degradación del tirosol, los experimentos en adelante se 
realizaron a 50ºC. 
Disminuir el porcentaje de lipasa inmovilizada que se añade a la mezcla de reacción tiene como mayor ventaja la disminución del coste del bioproceso, además de disminuir la cantidad de material sólido en la mezcla de reacción, un hecho que es especialmente relevante cuando el porcentaje de material sólido en la mezcla de reacción es muy alto, se debe tener en cuenta que al comienzo de la reacción el tirosol representa aproximadamente el 33% de la mezcla de reacción. Se compararon dos porcentajes diferentes de lipasa inmovilizada en la síntesis enzimática de oleato de tirosol, 5% y 10% w/w. La reducción de la cantidad de biocatalizador, produjo una disminución significativa en la velocidad de la reacción con las dos lipasas inmovilizadas, por lo tanto se utilizó un 10% en peso de biocatalizador en los experimentos posteriores. 
Todas las reacciones de esterificación llevadas a cabo a presión atmosférica condujeron a una mezcla de productos compuesta por oleato de tirosol y cantidades variables de ácido oleico y tirosol sin reaccionar. Con el fin de desplazar el equilibrio de la reacción hacia la formación de oleato de tirosol, el agua producida durante la reacción de esterificación debía ser eliminada.
Para alcanzar este objetivo se pueden utilizar diferentes estrategias, tales como el borboteo de nitrógeno, la utilización de un desecante o la realización de la reacción a presión reducida. Al hacer la reacción a vacío (200 mbar) se obtuvo una mezcla de productos compuesta por más de un 85% de oleato de tirosol en menos de 3 horas, tanto con Novozym 435 como con la lipasa de Candida antárctica inmovilizada en los aglomerados de octil-silice. Sin embargo se necesitó mayor vacío para eliminar por completo el agua de la mezcla de reacción. Por lo tanto, para alcanzar una conversión de ácido oleico y tirosol superior al 85% se utilizó un vacío de 10 mbar. 
Bajo estas condiciones se obtuvo una mezcla de productos compuesta por más de un 95% de oleato de tirosol, en 2 horas para Novozym 435 y en 3 horas para lipasa de Candida antárctica inmovilizada en los aglomerados. El distinto contenido en agua de las dos enzimas inmovilizadas (1,77% para Novozym 435 y 2,17% para el aglomerado de octil-sílice) también podría desempeñar un papel importante en la velocidad de reacción observada. 

Otro aspecto importante a tener en cuenta fue la volatilidad parcial del tirosol. Otros autores [5] habían observado que un vacío y temperatura excesivos podrían conducir a la destilación parcial del tirosol. Con el fin de evaluar la evaporación parcial del tirosol se puso a vacío (10mb) durante 8 horas una mezcla de reacción similar a la descrita anteriormente, pero sin la adición de enzima. Transcurrido este tiempo una parte alícuota de la mezcla fue analizada y el contenido de tirosol fue comparado con el de la mezcla inicial. Se observó un porcentaje idéntico de tirosol en las muestras analizadas, lo que indica que bajo las condiciones experimentales ensayadas, la evaporación del tirosol es despreciable. 
Eliminar el agua de la mezcla de reacción puede tener dos efectos contrapuestos: 1) desplazar el equilibrio de la reacción hacia la formación de oleato de tirosol y 2) deshidratar la lipasa inmovilizada, lo que afecta a la actividad residual de los biocatalizadores. Como se ha dicho anteriormente la reutilización de la lipasa es un factor clave en la biocatálisis aplicada. Por lo tanto se debe llegar a un equilibrio entre la velocidad de reacción y la estabilidad enzimática. Con el fin de comprobar la actividad residual de la lipasa después de la reacción de esterificación, se realizaron tres ensayos consecutivos con el mismo lote para ambas lipasas. 
La recuperación del biocatalizador es el principal inconveniente para la reutilización de la lipasa en reactores discontinuos. Una de las principales dificultades es la separación del producto de la reacción de la enzima inmovilizada. En un estudio de reutilización del 
biocatalizador el primer ensayo no es comparable con el segundo y tercero, ya que en el primero se utiliza enzima fresca y limpia, y en el segundo y tercero la enzima se encuentra impregnada del medio de reacción. Una estrategia para hacer los tres ensayos comparables entre sí es realizar una inmersión de la lipasa fresca en la mezcla de reacción durante cinco minutos para luego secarla a vacío antes de su utilización en los siguientes ensayos. Pero este procedimiento no pudo ser usado en el presente estudio debido a que la mezcla de reacción inicial contenía una alta proporción de material sólido (tirosol no disuelto), que podía interferir negativamente en la recuperación del biocatalizador por filtración a vacío. No obstante debe tenerse en cuenta que, después de 60 minutos de reacción enzimática a 50ºC y 10 mbar, el tirosol se encontraba disuelto por completo en la mezcla de reacción y por lo tanto, la recuperación de la lipasa fue factible en los tiempos de reacción de más de 1 hora. 
Los ensayos 2 y 3 para la síntesis enzimática de oleato de tirosol (ambos realizados con lipasa impregnada recuperada de la mezcla de reacción del primer ensayo) desarrollaron una velocidad de reacción similar, lo que indica que la inactivación para los dos inmovilizados enzimáticos puede considerarse insignificante. También se pudo observar que, para los dos inmovilizados bajo estudio, los ensayos 2 y 3 fueron más lentos que el primer ensayo. Esto puede atribuirse al aumento de las limitaciones de difusión de los reactivos cuando la lipasa ha sido previamente sumergida en la mezcla de reacción. Con estas condiciones de reacción fue posible obtener una mezcla de productos compuesta por más de un 95% de oleato de tirosol, en 2 horas con Novozym 435 y en 5 horas con los aglomerados de octil-sílice. A pesar de que la estabilidad de ambos catalizadores fue similar, la velocidad de reacción alcanzada con los aglomerados de octil-sílice fue menor que con Novovozym 435. La optimización del inmovilizado por medio de aglomerados de octil-sílice, para la obtención de un biocatalizador más activo y/o con más carga de enzima por gramo de soporte, 
es necesaria. 
Con el objetivo de realizar una comparación de ambos biocatalizadores para la esterificación de tirosol con ácido oleico, ésta se llevó a cabo utilizando las mismas unidades de actividad (1.687 UA) de Novozym 435 y del inmovilizado de la lipasa de Candida antarctica en aglomerados de octil-sílice. Los resultados indicaron que la velocidad de reacción fue similar con las dos lipasas bajo estudio. Por tanto, concluyó que la diferencia en la velocidad de reacción no se debió a un aumento de las limitaciones de transferencia de materia o de difusión debido a los aglomerados de octil-sílice y por lo tanto, se pudo afirmar que las diferencias de velocidad de reacción observadas en los experimentos anteriores se atribuían exclusivamente a una mayor 
cantidad de miligramos de enzima por gramo de soporte en Novozym 435, en comparación con los de la lipasa de Candida antarctica inmovilizada en aglomerados de octil-sílice. Por esta razón, es conveniente llevar a cabo nuevos estudios con el fin de mejorar las capacidades de carga del nuevo soporte, pudiendo así incorporar una mayor cantidad de enzima por gramo de biocatalizador. 
Con el fin de conocer la actividad antioxidante del oleato de tirosol sintetizado y compararlo con la actividad del tirosol comercial se realizó la prueba del Rancimat. La actividad antioxidante está relacionada con el número de hidroxilos fenólicos, principalmente el orto-disustituido presente en algunos compuestos fenólicos pero no en el tirosol. Esto probablemente puede explicar la baja actividad antioxidante del tirosol descrita en varios estudios [6-7]. Sin embargo, el efecto antioxidante de los compuestos fenólicos en matrices lipídicas puede ser mejorado haciéndolos más lipófilos [8]. Al aumentar la concentración de oleato de tirosol en el aceite se observó un leve efecto protector contra la oxidación, casi linealmente dependiente hasta 3,7 mmol/kg (1,500 mg/kg), llegando a la mayor actividad antioxidante a 11,2 mmol/kg (4500 mg/kg), después la actividad antioxidante pareció disminuir a la mayor concentración evaluada (20 mmol/kg). Por el contrario, tirosol añadido a la misma concentración molar que el oleato de tirosol no mostró ningún efecto protector. De hecho fueron necesarias concentraciones mayores de tirosol (90 mmol/kg) para obtener un leve efecto protector. El estudio mostró que hacer el tirosol más lipófilo, por esterificación con ácido oleico, produce una ligera mejora de su capacidad antioxidante en el aceite. Del mismo modo, Torres de Pinedo y colaboradores [8] 
mostraron una mejora en el efecto antioxidante de los compuestos fenólicos en matrices lipídicas utilizando derivados de compuestos fenólicos esterificados con palmítico, esteárico y oleico. Por el contrario, Mateos y colaboradores [9] mostraron que los derivados de ésteres de tirosol, incluyendo oleato de tirosol, llevaron a un tiempo de inducción menor que el del tirosol libre, lo que sugiere un efecto antioxidante menor de los derivados lipófilos en matrices lipídicas. Este efecto antioxidante de los derivados lipófilos, contrario al producido por el oleato de tirosol en este trabajo, puede ser explicado por la utilización de una matriz de aceite diferente al del estudio 
de Mateos y colaboradores [9], realizado en aceite de oliva virgen extra. Por otro lado las condiciones Rancimat y las concentraciones de antioxidantes ensayadas fueron diferentes. Además, el diferente procedimiento para la producción de los ésteres de tirosol, podría conducir a diferentes actividades antioxidantes finales de los compuestos obtenidos. reacción observadas en los experimentos anteriores se atribuían exclusivamente a una mayor cantidad de miligramos de enzima por gramo de soporte en Novozym 435, en comparación con los de la lipasa de Candida antarctica inmovilizada en aglomerados de octil-sílice. Por esta razón, es conveniente llevar a cabo nuevos estudios con el fin de mejorar las capacidades de carga del nuevo soporte, pudiendo así incorporar una mayor cantidad de enzima por gramo de biocatalizador. 
Con el fin de conocer la actividad antioxidante del oleato de tirosol sintetizado y compararlo con la actividad del tirosol comercial se realizó la prueba del Rancimat. La actividad antioxidante está relacionada con el número de hidroxilos fenólicos, principalmente el orto-disustituido presente en algunos compuestos fenólicos pero no en el tirosol. Esto probablemente puede explicar la baja actividad antioxidante del tirosol descrita en varios estudios [6-7]. Sin embargo, el efecto antioxidante de los compuestos fenólicos en matrices lipídicas puede ser mejorado haciéndolos más lipófilos [8]. Al aumentar la concentración de oleato de tirosol en el aceite se observó un leve efecto protector contra la oxidación, casi linealmente dependiente hasta 3,7 mmol/kg (1,500 mg/kg), llegando a la mayor actividad antioxidante a 11,2 mmol/kg (4500 mg/kg), 
después la actividad antioxidante pareció disminuir a la mayor concentración evaluada (20 mmol/kg). Por el contrario, tirosol añadido a la misma concentración molar que el oleato de tirosol no mostró ningún efecto protector. De hecho fueron necesarias concentraciones mayores de tirosol (90 mmol/kg) para obtener un leve efecto protector. El estudio mostró que hacer el tirosol más lipófilo, por esterificación con ácido oleico, produce una ligera mejora de su capacidad antioxidante en el aceite. Del mismo modo, Torres de Pinedo y colaboradores [8] mostraron una mejora en el efecto antioxidante de los compuestos fenólicos en matrices lipídicas utilizando derivados de compuestos fenólicos esterificados con palmítico, esteárico y oleico. Por el contrario, Mateos y colaboradores [9] mostraron que los derivados de ésteres de tirosol, incluyendo oleato de tirosol, llevaron a un tiempo de inducción menor que el del tirosol libre, lo que sugiere un efecto antioxidante menor de los derivados lipófilos en matrices lipídicas. Este efecto antioxidante de los derivados lipófilos, contrario al producido por el oleato de tirosol en este trabajo, puede ser explicado por la utilización de una matriz de aceite diferente al del estudio de Mateos y colaboradores [9], realizado en aceite de oliva virgen extra. Por otro lado las condiciones Rancimat y las concentraciones de antioxidantes ensayadas fueron diferentes. Además, el diferente procedimiento para la producción de los ésteres de tirosol, podría conducir a diferentes actividades antioxidantes finales de los compuestos obtenidos.